大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告（大肠杆菌感受态细胞的制备）

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1、（1）质粒DNA的质量和浓度： 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。

2、一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。

3、对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。

4、此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

5、 （2）感受态细胞的质量： 所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃ （3）细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

6、不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。

7、细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。

8、即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。

9、对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。

10、（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。

11、密度过高或不足均会使转化率下降。

12、 （二）感受态细胞转化中的影响： 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。

13、所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

14、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

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